生物有机肥中枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌检测方法的建立

黄景麟郭秀琴陈聪张小骥江一飞

三峡公共检验检测中心·国家磷产品质量监督检验中心，湖北宜昌 443002

摘要：使用传统细菌生化鉴定或全自动微生物鉴定系统VITEK 2 compact难以区分枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，因此建立鉴定微生物肥料中枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的多重实时荧光聚合酶链式反应（PCR）检测方法具有实际意义。对实际生物有机肥样品进行检测，结果显示，该方法特异性好，抗干扰力强，为生物有机肥中有效活菌种类鉴定提供了技术支撑。

关键词：多重实时荧光聚合酶链式反应（PCR）；枯草芽孢杆菌；解淀粉芽孢杆菌；生物有机肥

中图分类号： S858

0 引言

时隔43年，国家重启全国第三次土壤普查，实施耕地的“全面体检”，通过检验检测查明农用地土壤目前的物理性质，从而更有效的指导生产实践，贯彻新发展理念，守耕地红线、保国家粮食安全，推进农业发展绿色转型、新时代高质量发展、促进生态文明建设和助力乡村振兴。

表1 枯草芽孢杆菌与其他类似芽孢杆菌的鉴别特征
项目	枯草芽孢杆菌（B.subtilis）	解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）	地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）	蜡样芽孢杆菌(B.cereus)
7%氯化钠生长	+	+	+	d
pH5.7生长	+	+	+	+
淀粉水解	+	+	+	+
明胶液化	+	+	+	+
厌氧生长	-	d	+	+
D-木糖 L-阿拉伯糖 D-甘露醇	+	+	+	-
	+	+	+	-
	+	+	+	-
丙酸盐柠檬酸盐	-	d	+	ND
丙酸盐柠檬酸盐	+	+	+	+
注：+:阳性；-：阴性；d：部分菌株为阳性；ND：未测定。

生物有机肥是将秸秆豆粕、家禽粪便、植物产物等农业固体有机废弃物通过适当的生产工艺再往其中加入各种微生物菌种复合而成的肥料，使其具备增强作物对恶劣环境的适应性，改善土壤理化性质，调节生态平衡^[1]，提高土壤营养成分等优点^[2]。可以预见，作为全国第三次土壤普查结果应用的一部分，生物有机肥可以改善和恢复传统肥料过度使用造成的土壤板结、酸化加剧、盐碱化严重等土质变更，因此建立检测方法，鉴定生物有机肥中有效活菌的种类显得十分迫切。

枯草芽孢杆菌群（Bacillus subtilis group）作为常见生物有机肥生产用菌株，是枯草芽孢杆菌及其近缘种的总称，其包括枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、解淀粉芽孢杆（B.amyloliquefaciens）和萎缩芽孢杆菌（B.atrophaeus）等。枯草芽孢杆菌群细菌能够改良盐碱地土壤、对苯并芘等有害物可进行吸附或生物降解，提升土壤呼吸强度从而保护环境^[3]。其中，枯草芽孢杆菌能够分泌多种蛋白类和激素类活性物质,天然无毒害,是一种高效、经济、环保的微生物“工具”^[4]；解淀粉芽孢杆菌是一类植物根际促生细菌(PGPR),PGPR菌株在作物保护、通过分解土壤中难溶的磷、钾，产生激素类物质促进植物生长^[5]和改良土壤等方面发挥着重要作用^[6]。

目前，使用传统的细菌生化鉴定方式或者全自动微生物鉴定系统VITEK 2 compact都难以区分枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌（菌种生化鉴别特征见表1），现行的GB/T 26428-2010《饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》、SN/T 4624.15-2016《入境环保用微生物制剂检测：解淀粉芽孢杆菌》检测方法仅适用于微生物制剂，不适用于成分更加复杂的土壤、生物有机肥等混合菌种样品（结论2.1其菌落形态基本一致）。因此迫切需要找到传统鉴定方法以外的鉴定方式，用于开展检验检测工作、指导农业科学施肥生产实践。

本文以生物有机肥中常见的枯草芽孢杆菌和解淀粉孢杆菌为材料，建立了应用于鉴定生物有机肥中有效活菌的多重荧光PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 采用的菌株

本方法所采用菌株共4株。其中目标菌枯草芽孢杆菌（CMCC 63501）、沙门氏菌（CMCC 50115）：中国医学细菌保藏中心；解淀粉芽孢杆菌（CICC 10026）、大肠埃希氏菌O157（CICC 10907）：中国工业微生物菌种保藏管理中心。所有菌株均为本实验室保存。实验前，所有标准菌株采用营养肉汤培养基（NB）活化后用养琼脂培养基（NA）划线分离得到新鲜的纯化菌落。

1.1.2 试剂

营养肉汤培养基（NB）：青岛海博，货号HB0108，批号20200606；营养琼脂培养基(NA)：青岛海博，货号HB0109,批号20200905；VITEK 2芽孢杆菌鉴定试卡（BCL）：梅里埃，货号21345，批号2391888103；MightyPrep reagent for DNA：TakaRa，货号9182,批号AKG2462A。罗氏诊断核酸提取试剂盒，货号07658036001 ,批号 07658036001（1.3）。2×Probe TaqMan Fast qPCR 预混液：生工生物（上海），货号B639274-0001,规格：1mL。E-GEL EX琼脂糖凝胶2%：赛默飞，货号G401002,批号U151222-01。DNA分子量标准MARKER（100-2000bp）：上海生工，货号B500350，批号IB01KA7006。 Sample Loading Buffer：赛默飞，批号01123605。

1.1.3 引物序列与探针

引物序列与探针：详细信息见表二。枯草芽孢杆菌qPCR上游引物、下游引物、探针序列来源于标准SN/T 2728-2010《枯草芽孢杆菌检测鉴定方法》所述，同时重新修饰了探针。不同菌种的基因差异主要集中在pgsB基因中，因此，通过NCBI的数据库GENBANK中查找到解淀粉芽孢杆菌的pgsB基因，设计的上游引物、下游引物、探针。枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌qPCR上游引物、下游引物、探针均为生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 引物序列

目标菌种	引物序列
枯草芽孢杆菌（B.subtilis）	上游引物5^,-GCGGAATCATCCGTATTGGGGCAGA-3^,
枯草芽孢杆菌（B.subtilis）	下游引物5^,-AACCTCGCGGGCTTTCTCGCCAA-3^,
解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）	上游引物5^,-TGGCGCCATGAGAATCCT-3^,
解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）	下游引物5^,-GCAAAGCCGTTTACGAAATGA-3^,

表3 探针序列

目标菌种	荧光探针标记
枯草芽孢杆菌（B.subtilis）	5^,-FAM-AACTGAACTGACTGCCGAAGAACGCCT-BHQ1-3^,
解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）	5^,-VIC-CCGCTGCTCAGCACGAAGGAGC-BHQ2-3^,

1.1.4 设备与仪器

天平：ME 2002，梅特勒；冷冻离心机：5804R，艾本德；生物安全柜：TELSTAR Bio-Ⅱ-A；高压灭菌锅：G180TW，厦门致微ZEALWAY ；全自动微生物鉴定系统：VITEK 2 compact，梅里埃；生化培养箱：LRA-250A,韶关市泰宏医疗器械有限公司；微量分光光度计：Nano-300，杭州奥盛；全自动核酸提取仪：NagNA Pure24，罗氏诊断Roche；荧光定量PCR仪：ABI 7500，赛默飞世尔科技；恒温水浴锅：全功能手工正置显微镜：DM 2000,莱卡LEICA；漩涡混合器：VORTEX-2,Scientific Industries；恒温金属浴：MINIG-100,莱普特科学仪器（北京）有限公司；电泳凝胶成像仪：invitrogen，赛默飞世尔科技。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定

1.2.1.1 形态观察

配制营养肉汤（NB），分别将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌接种活化。用接种环四分区划线法于营养琼脂培养基(NA)划线，经生化培养箱36℃±1℃培养48h±2h后得到生长状态良好的菌种板。挑取单个菌落进行纯化，观察单个菌落形态。菌体形态观察采用革兰氏染色法。

1.2.1.2 生化鉴定

将1.2.1.1得到的纯化后的单菌落分别用0.45%生理盐水稀释，制成0.5个麦氏浓度的菌悬液，采用VITEK 2芽孢杆菌鉴定试卡（BCL）上机获得细菌生化鉴定结果。

1.2.2 细菌DNA提取方法的比较与选择

1.2.2.1 直接裂解法提取DNA

所有菌株经营养肉汤培养基活化后取1mL纯培养液或增菌液，10000rpm离心2min，弃上清，加入MightyPrep reagent for DNA（TakaRa）试剂100μL直接裂解提取细菌DNA，恒温金属浴：MINIG-100，95℃加热10min，以营养肉汤培养基提取物为阴性对照，以无菌、无DNAase酶超纯水为空白对照。

1.2.2.2 全自动核酸提取仪提取DNA

取1mL经营养肉汤培养基活化后的纯培养液或增菌液，用罗氏诊断全自动核酸提取仪提取细菌DNA，以营养肉汤培养基提取物为阴性对照，以无菌、无DNAase酶超纯水为空白对照。

1.2.2.3 DNA浓度、纯度的计算

取1mL营养肉汤培养基增菌液按照1.2.1.1和1.2.1.2的方法分别提取细菌DNA，稀释一定倍数后，以无菌、无DNAase酶超纯水为对照，用微量分光光度计测出样本提取液在230nm、260nm、280nm波长处的吸光值。DNA溶液的的纯度用A260/A280、A260/A230的比值来表示，A260/A280越接近1.8、A260/A230的比值比值接近2.0，表明提取到的DNA纯度越好。

1.2.3 单重荧光PCR反应

将提取得到的枯草芽孢杆菌基因组DNA作为模板进行扩增。单重荧光PCR反应体系：加入预混液2×Probe TaqMan Fast qPCR 10μL，枯草芽孢杆菌qPCR探针1μL，枯草芽孢杆菌探针qPCR上下游引物混合液2μL，待测DNA模板 9μL，PCR阴性对照、空白对照补足至25μL。反应参数：每个循环设置为预变性阶段95℃保持5min；变性阶段95℃持续15sec，60℃退火并延伸60sec，40个循环，最后在退火延伸阶段采集FAM通道荧光信号。

将提取得到的解淀粉芽孢杆菌的基因组DNA作为模板进行扩增。单重荧光PCR反应体系：加入预混液2×Probe TaqMan Fast qPCR 10μL，解淀粉芽孢杆菌qPCR探针1μL，解淀粉芽孢杆菌探针qPCR上下游引物混合液2μL，待测DNA模板 9μL，PCR阴性对照、空白对照补足至25μL。每个循环设置为预变性阶段95℃保持5min；变性阶段95℃持续15sec，60℃退火并延伸60sec，40个循环，最后在退火延伸阶段采集VIC通道荧光信号。

阴性对照为营养肉汤培养基提取物9μL，空白对照为配制的无菌、无DNAase酶超纯水25μL。

1.2.4 多重荧光PCR反应的建立

混合两组上游引物、下游引物及探针，并在使用量上科学配比验证，最终确认多重荧光PCR反应体系是否能够成功建立。阴性对照为营养肉汤培养基提取物，空白对照为配制的无菌、无DNAase酶超纯水。

1.2.5 PCR扩增产物电泳分析

使用E-GEL EX 2%琼脂糖凝胶，每个样品孔加入5μLPCR扩增产物，同时加入5μL上样缓冲液，DNA分子量标准MARKER（100-2000bp）10μL做参照，恒压电泳13min，电泳结果用invitrogen成像分析系统记录并保存。

1.2.6 常见细菌性污染源的特异性试验

验证建立的方法的特异性，与常见细菌性污染源是否产生非特异性扩增。阴性对照为营养肉汤培养基提取物，空白对照为配制的无菌、无DNAase酶超纯水。

1.2.7 生物有机肥样品检测方法的探究

以无菌操作将待检样品（主要菌株为枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌）25g用磷酸缓冲溶液225mL制成10^-1至10^-10的稀释液，选择适宜的4个连续稀释梯度的菌液1mL于一次性无菌平皿内，将冷却到45℃±2℃的营养琼脂倒入平皿，顺时针或逆时针保持一个方向轻轻混匀培养基制成混板，每个稀释度做两个平行样。分别挑取平板上若干个污白色菌落进行形态学鉴定并挑取单菌落进行生化鉴定；另转接营养肉汤30℃±1℃于生化培养箱内培养增菌培养24小时后待用。

运用1.2.1中的方法提取细菌DNA，根据1.2.2建立的方法进行多重荧光PCR检测，阴性对照为营养肉汤培养基提取物9μL，空白对照为配制的无菌、无DNAase酶超纯水25μL。

2 结果与分析

2.1 细菌形态与生化鉴定结果

枯草芽孢杆菌（B.subtilis）在营养肉汤培养基中生长时，形成皱醭。通过平板四分区划线法观察单个的菌落，其形态特征如图1所示：菌落粗糙不透明，污白色，黏着，边缘整齐。菌体观察通过革兰氏染色法得到，镜检结果如图3所示：革兰氏呈紫色，阳性

表4 枯草芽孢杆菌VITEK 2 compact生化鉴定结果（n=10）
1	BXYL	+	3	LysA	-	4	AspA	-	5	LeuA	-	7	PheA	(+)
8	ProA	-	9	BGAL	+	10	PyrA	+	11	AGAL	+	12	AlaA	(-)
13	TyrA	+	14	BNAG	-	15	APPA	+	18	CDEX	-	19	dGAL	-
21	GLYG	-	22	INO	(+)	24	MdG	+	25	ELLM	+	26	MdX	-
27	AMAN	-	29	MTE	-	30	GlyA	(-)	31	dMAN	+	32	dMNE	-
34	dMLZ	-	36	NAG	-	37	PLE	+	39	IRHA	-	41	BGLU	+
43	BMAN	-	44	PHC	-	45	PVATE	(+)	46	AGLU	(-)	47	dTAG	-
48	dTRE	+	50	INU	-	53	dGLU	+	54	dRIB	(-)	56	PSCNa	-
58	NaCl	+	59	KAN	-	60	OLD	-	61	ESC	+	62	TTZ	+

表5 解淀粉芽孢杆菌VITEK 2 compact生化鉴定结果（n=10）
1	BXYL	+	3	LysA	-	4	AspA	-	5	LeuA	-	7	PheA	+
8	ProA	-	9	BGAL	-	10	PyrA	+	11	AGAL	+	12	AlaA	-
13	TyrA	+	14	BNAG	-	15	APPA	+	18	CDEX	-	19	dGAL	-
21	GLYG	-	22	INO	-	24	MdG	+	25	ELLM	-	26	MdX	-
27	AMAN	-	29	MTE	-	30	GlyA	+	31	dMAN	+	32	dMNE	+
34	dMLZ	-	36	NAG	-	37	PLE	+	39	IRHA	-	41	BGLU	+
43	BMAN	-	44	PHC	-	45	PVATE	-	46	AGLU	-	47	dTAG	-
48	dTRE	+	50	INU	-	53	dGLU	+	54	dRIB	+	56	PSCNa	-
58	NaCl	+	59	KAN	-	60	OLD	-	61	ESC	+	62	TTZ	-

表6 不同方法提取细菌DNA的纯度
菌种名称	方法	A230	A260	A280	A260/A280	A260/A230
枯草芽孢杆菌（B.subtilis）	直接裂解法	1.339	1.112	0.577	1.93	0.83
枯草芽孢杆菌（B.subtilis）	全自动提取法	1.744	1.673	0.881	1.90	0.96
解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）	直接裂解法	1.952	1.581	0.841	1.88	0.81
解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）	全自动提取法	2.314	2.202	1.165	1.89	0.95
注：表三数据均为三次重复实验平均值

图1 枯草芽孢杆菌菌落形态

图2 解淀粉芽孢杆菌菌落形态

菌，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

通过平板四分区划线法观察解淀粉芽孢杆（B.amyloliquefaciens）单个的菌落，其菌落形态特征如图2所示：菌落粗糙不透明，污白色，黏着，边

图3 枯草芽孢杆菌镜检结果

图4 解淀粉芽孢杆菌镜检结果

缘整齐。菌体观察通过革兰氏染色法得到，镜检结果如图4所示：革兰氏呈紫色，阳性菌，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

实验结果表明，从菌落形态、菌体观察上难以区分枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、解淀粉芽孢杆（B.amyloliquefaciens）这两种芽孢杆菌。

枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、解淀粉芽孢杆（B.amyloliquefaciens）生化鉴定结果如表4、表5所示，63种生化结果亦十分接近，枯草芽孢杆菌CMCC 63501的实验结果为93%概率 Bacillus subtilis/amyloliquefaciens/atrophaeus。解淀粉芽孢杆菌CICC 10026的实验结果为92%概率Bacillus subtilis/amyloliquefaciens/atrophaeus。因此单纯使用VITEK 2 compact 无法鉴别这两种芽孢杆菌。

不过令人欣喜的是，在平行实验中（n=20）有了进展，全部支持了枯草芽孢杆菌(CMCC 63501)β-半乳糖苷酶（BGAL）试验为阳性、解淀粉芽孢杆菌(CICC 10026)半乳糖苷酶（BGAL）试验为阴性，为本文论述的两种芽孢杆菌的快速鉴定如芽孢杆菌生化鉴定条的开发提供了一定的参考价值和试剂改进方式。

2.2 不同方法提取的结果

由表6可见，直接裂解法和全自动提取法获得DNA，测得A260/A280在1.9左右，A260/A230<1.0，表明均较好的提取出了细菌DNA，但直接裂解法有较多的蛋白残留。实验表明，采用全自动核酸提取仪提取的DNA纯度要更高，提取效果更好。

2.3 单重及多重荧光PCR扩增结果

图5 枯草芽孢杆菌荧光PCR结果

图6 解淀粉芽孢杆菌荧光PCR结果

在25μL反应体系中加入10μL2×Probe TaqMan Fast qPCR 预混液，对两株目标菌株的引物和探针的使用量进行优化，实验证实，设计的两对引物探针能够分别顺利扩增，同时不产生非特异性扩增，可以构建多重荧光PCR反应体系。确立本实验最终反应体系为：2×Probe TaqMan Fast qPCR 预混液 10μL，枯草芽孢杆菌上游引物、下游引物各1μL、qPCR探针1μL，解淀粉芽孢杆菌上游引物、下游引物各1μL、qPCR探针1μL,待测DNA模板9μL。反应参数：95℃预变性5min；95℃变性15sec，60℃退火并延伸60sec，40个循环，在每个循环的退火延伸阶段采集荧光信号，枯草芽孢杆菌采集FAM通道，解淀粉芽孢杆菌采集VIC通道。阴性对照为营养肉汤培养基提取物9μL，空白对照为配制的无菌、无DNAase酶超纯水25μL。实验结果见图7。

图7 枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌多重荧光PCR结果

2.4 PCR扩增产物电泳结果

枯草芽孢杆菌预期扩增产物为137bp，解淀粉芽孢杆菌预期扩增产物为50bp。图8 结果表明多重荧光PCR成功建立。1、2通道为枯草芽孢杆菌；3、4通道为解淀粉芽孢杆菌；5-8通道为多重荧光PCR扩增体系产物。

图8 多重荧光PCR产物电泳结果

2.5 生物有机肥样品的DNA扩增结果及特异性试验结果

运用建立的多重实时荧光PCR方法检测枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，同时扩增沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7基因组DNA，结果见图9。结果表明，目标菌株（枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌）有扩增曲线，非目标菌株（沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7）无扩增曲线，证明本实验建立的方法具有良好的特异性，与常见细菌性污染源不会产生非特异性扩增。

图9 生物有机肥样品的DNA扩增结果及特异性试验结果

3 结论与讨论

虽然大量实验证实枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、解淀粉芽孢杆（B.amyloliquefaciens）63种生化鉴定结果十分接近，但枯草芽孢杆菌(CMCC 63501)β-半乳糖苷酶（BGAL）试验为阳性，解淀粉芽孢杆菌(CICC 10026)半乳糖苷酶（BGAL）试验为阴性，为本文论述的两种芽孢杆菌的快速鉴定如芽孢杆菌生化鉴定条的开发提供了一定的参考价值和试剂改进方式。

本研究表明，相比直接裂解法，采用罗氏全自动核酸提取仪及其试剂具有更好的DNA提取效果、纯度更高，A260/A280约为1.9，A260/A230接近1.0。

设计了引物、探针序列，成功建立了鉴定生物有机肥中枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的FAM、VIC双通道多重实时荧光定量PCR检测方法，解决了实验室运用传统生化鉴定方法难以区分上述两种芽孢杆菌及定量检测的问题，且具有良好的微生物特异性，不会被常见致病菌扩增信号所干扰，对实验室检验检测工作（生物有机肥中有效活菌种类鉴定、含量测定项目）具有实用价值，为后续相关检验标准的修订、建立打下实验基础。

芽孢杆菌群中其他可作为生物有机肥有效活菌如甲基芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌本实验室暂未收录，其检测方法还有待下一步研究。

参考文献

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作者简介：黄景麟（1989—），男，汉族，湖北宜昌人，硕士研究生，三峡公共检验检测中心宜都分中心副主任，食品工程师职称，主要从事食品、产品检验检测及科研工作。

基金项目:本科题《生物有机肥中枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌检测方法的建立》由三峡公共检验检测中心承担，为2022年度宜昌市自然科学研究项目（编号A22-3-036）。

生物有机肥中枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌检测方法的建立

黄景麟1郭秀琴1陈聪1张小骥1江一飞1

黄景麟¹郭秀琴¹陈聪¹张小骥¹江一飞¹