比较多管发酵法和酶底物法测定水中总大肠菌群的一致性

唐佳琴姜万祥

云南省玉溪市华宁县疾病预防控制中心，云南华宁 652800

摘要：目的用酶底物法和多管发酵法检测18份自来水厂进厂水，比较两种方法在检测生活饮用水中的一致性和优劣性，判定在笔者所在基层实验室利用现有的实验条件，对于生活饮用水内的总大肠菌群检测是否可用酶底物法直接取代多管发酵法的方式，精准评估生活饮用水卫生情况。方法乳糖蛋白胨多管发酵法与51孔定量盘酶底物法。结果选择检测的两种方式一致，二者差异不存在统计学意义（P＞0.05）。结论相比较多管发酵法，酶底物法的整体操作简单快捷，并且能满足大批量水样检测从而提高检测效率和提升实验室检测和处突应变的能力。在基层经济允许的情况下值得大力推广使用。

关键词：自来水；饮用水；大肠菌

中图分类号：R123

水是人类生存的基本物质，同时也是许多疾病传播的媒介。据统计，我国每年有近30万人因饮用受污染的水而患上急性肠道传染病。由大肠菌群引起的肠道传染病在农村地区尤为突出。而水中总大肠菌群是评价饮用水是否受肠道致病菌污染的指标^[1-2]。目前我单位生活饮用水中总大肠菌群监测主要是采用传统的多管发酵法，这种检测方法应用广泛使用成本相对较低，但实验前准备工作复杂，需要配备大量的人力物力，试剂配制要求严格，检测时间长，且需验证实验，步骤繁琐，并且我所在单位为基层单位，现有的设备和人员有限，一批次所做能检测样本有限，不能对生活饮用水的卫生学状况做出快速评价，尤其是在水源性卫生应急事件快速检测中存在局限性，不能满足快速检测的需求^[3-5]。而酶底物法能借助成品试剂进行检测，不用做复杂的前期准备工作，操作快捷简单，无需多次试验，检测时间较快，最短18小时以内就能获得检测结果，一般情况下是24小时以内。

对此，文章对生活饮用水中总大肠菌群的一致性进行检测，选择的检测方法是多管发酵法、酶底物法；对当前实验室环境下，是否可用酶底物法直接取代多管方法的方式测定水中总大肠菌群从而提高检测的效率。

1 材料与方法

1.1 样品

为确保最终所得到的检测结果真实可靠，整个过程中所选择的水样均取自同一水源地，为了使水样中具有一定的阳性率，我选择对盘溪镇2022年1月至2023年7月每月次进厂水用酶底物法和多管发酵法进行了总大肠菌群检测，收集数据。

1.2 实验材料

1.2.1 检测设备

HH.B11.500电热恒温培养箱、MSL-3750实验室高压灭菌器、GR-246干燥灭菌器、Quanti-traysealer pluss水质封口机。

1.2.2 试剂

在每一次试验操作中所使用的培养基均按照厂家提供说明书按比例配制，严格灭菌和控制好灭菌温度及压力，避免温度太低达不到灭菌效果，温度太高改变培养基的Ph值和破坏培养基物质结构，特别是乳糖－蛋白胨培养基最好现配现用，不能反复高压灭菌。

2 试验方法

2.1 多管发酵法

2.1.1 原理

依照水样内存大肠菌群在48小时迟缓发酵乳糖形成酸气或者在37℃温度下培养24发酵乳糖产酸产气的特征，借助15管法，采取乳糖蛋白胨接种的方式对水样检测，开展复发酵试验，如伊红美蓝培养基分离、初发酵以及再用乳糖蛋白胨，而后依照复发酵管的管数查看MPN检索表并将检测试验结果报告出来。

2.1.2 具体步骤

根据检测生活饮用水标准检验的方法微生物指标》（GB／5750.12—2006）执行检测。

表1 试剂
试剂名称	生产厂家	批号	效期
ONPG-MUG培养基	科立得	EU476	20230708
乳糖蛋白胨培养基	青岛高科技工业园海博生物技术有限公司	20210312	20240311
伊红美蓝培养基	青岛高科技工业园海博生物技术有限公司	20201012	20231011
大肠埃希菌标准菌株	广东环凯微生物科技有限公司	FSCC149005	第一代

表2 检测结果汇总表
样品编号	酶底物法MPN/100ML	多管发酵MPN/100ML
1	0	0
2	4	4
3	200.5	180
4	88.5	84
5	144.5	140
6	200.5	210
7	165.2	170
8	200.5	210
9	27.1	26
10	22.2	22
11	200.5	210
12	200.5	180
13	65.9	64
14	50.4	50
15	40.6	42
16	0	0
17	129.8	130
18	101.3	95

2.1.3 乳糖发酵试验

取10mL水样接种到在10mL双料乳糖蛋白陈培养液内取10ml水样接种，在10ml的单料乳糖蛋白胨培养液内取1ml水样接种；在9mL灭菌生理盐水中取1ml水样注入，将其均匀混合，吸取1ml在10mL单料乳糖蛋白陈培养液内注入，每个稀释度接种5管，在36℃±1℃培养箱放置接种管，将其培养2h±24h，若是全部乳糖蛋白胨均没有气、酸产生，那么，要适当延长培养时间；若是培养24h后依旧没有气、酸产生，可将总大肠菌群报告呈阴性，并以标准菌株与其对照。

2.1.4 分离培养

若是有气、酸产生，需在伊红美蓝琼脂平板中把产生气、酸的发酵管分别转种，并放置在36℃ ±1℃培养箱中培养18h-24h，对菌落形态进行观察，选择与下方特征相符的菌落开展镜检革兰氏染色、证实试验。

淡紫红色且中心位置颜色深的菌落；

菌落呈现出紫黑色且略带或不带金属光泽；深紫黑色、呈现出金属光泽的菌落；

2.1.5 证实试验：通过上方的染色镜检，我将其报告成革兰氏阴性无芽孢杆菌，并选择乳糖蛋白胨培养液接种，在36℃ ±1℃ 培养箱内放置后，将其培养2h±24h后，若是有气、酸产生，那么，证实存在大肠菌群，清晰界定总大肠菌群阳性的管数查MPN检索表，将每10ml水样内的MPN值报告出来。

2.2 酶底物法

2.2.1 原理

当水中存在大肠菌群，那么，大肠菌群形成的β-半乳糖苷酶能将水内的色原底物直接分解，还可将色原体释放出来，让培养液变黄，依照培养后水样颜色变化，对黄色孔数计数，查表报告100ML水样最大可能数。

2.2.2 试验步骤

水样稀释：对实际所需的100ml水样进行检测，如果检测结果表明水样遭受严重污染，那么需要选择稀释，在90mL无菌生理盐水内注入10ml水样，若是情况许可，需将稀释度加大。

2.2.3 定性反应

在100ml无菌稀释瓶内加入100ml水样，添加

2.7gMMO-MUG的培养基粉末，将其均匀搅拌，待充分溶解后，放入36℃±1℃的培养箱内培养24h。

2.2.4 51 孔定量盘法

在入100mL无菌稀释瓶内添加2.7gMMO-MUG培养基粉末、100ml水样中，将其均匀搅拌溶解后，在51孔无菌定量盘中直接导入100ml水样，将定量盘背面的孔穴气泡消除，借助程控定量封口机对其封口，让其在36℃±1℃的培养箱内放置24h。

表3 配对样本检验统计表
	配对差值					t	自由度	显著性（双尾）
	平均值	标准差	标准误差平均值	差值 95% 置信区间
				下限	上限
配对 1 酶底物法多管发酵法	1.5111	8.3439	1.9667	-2.6382	5.6604	.768	17	.453

2.2.5 结果判读

将培养24h之后的定量盘取出观察，若是结果显示可疑阳性，那么，可将培养时间延长到28h后再读取结果；28h后呈现出的颜色不代表阳性结果；若是孔穴中的水样呈现出黄色，代表此孔穴内涵盖总大肠菌群，并将呈现出黄色反应的孔穴数计算出来，与51孔定量盘MPN表对照，将表示总大肠菌群的MPN值找出，并用MPN/100ml的方法表示；若是全部孔没有黄色产生，可将其报告成未检出总大肠菌群.

2.3 数据分析方法：

借助SPSS 23.0软件，将收集数据选择酶底物法、多管发酵法检测并开展正态分布检验，若是检测数据与正态分布符合，即可把数据开展配对t检验，可得出结果t为 0.768 ，P﹥0.05 。酶底物法与多管发酵法的检测结果一致，两者差异无统计学意义。

3 讨论

多管发酵法作为最早的水中总大肠菌群检测的方法一直沿用至今，最根本的原因是这种检测方法使用成本低，对检测人员的要求不是很高，只要普通医学院校检验专业经过基本的微生物培训都可以操作。但随着社会发展和进步人们生活水平的不断提高，人们对水质的要求也在不断提高^[6-8]。在当前阶段，对水样质量检测工作也提出了更高要求。而多管发酵法由于检测试剂为半成品，使用时需要配制和高压灭菌等一序列的准备过程，并且配制好的试剂存储时间不长，检测时对实验室要求高等缺点越来越不能满足生活饮用水中总大肠菌群的大批量检测和水源性卫生应急事件快速检测的需求，并且只要其中一个环节失误都可能会影响最终的检测结果、不能准确反馈检测结果、对水质监测工作极为不利^[7]。

酶底物法作为一种新兴的微生物检测方法，利用大肠菌群产生的β-半乳糖苷酶能分解色原底物释放出色原体使培养液呈现颜色这一特点特异性强，能减少其他非特异菌的干扰，准确度高，降低了漏检率。酶底物法为一步测定，无需做确认实验，配置好水样，放入程控定量封口机分配水样加热封口，再放入培养箱培养24小时就可以判定结果^[8-10]。具有操作简便的特点，通过简单培训就能轻松使用，不会因为多次稀释而导致结果不准确；并且不需要特殊的仪器设备，对实验室要求不高，特别是遇到突发性水源卫生事件，在现场就可以完成检测^[3]。

酶底物法试剂为成品试剂，厂家提供性能验证报告，无需再做性能验证实验^[11]。并且此方法不仅可以检测水中总大肠菌群还可以检测大肠埃希菌氏菌，该菌在评价水源污染情况比总大肠菌群更有病原学意义。

酶底物法试剂简单，所占空间小，不像多管发酵法培养需要大量试管和试管架、培养箱。特别是我所在单位为基层实验室，现在所具备实验条件用多管发酵法每次最多能做50个样品，大大降低了工作效率。酶底物法操作简单，检测时间比较短，但在检测过程中某些细节或操作不当也会导致检测结果出现偏差，所以在实际操作过程中需要对测定参数进行精准控制，平常要加强对仪器设备的检查维护，使用仪器的检测人员要加强培训^[12]。

4 结论

通过以上的两种方法的比对，多管发酵法、酶底物法检测生活饮用水的结果一致，二者差异不存在统计学意义。酶底物用于生活饮用水那种大肠菌群检测时，可直接用多管发酵法代替，从而能够对水质微生物污染的实际情况进行评价。同时新的国家标准还增加了大肠埃希菌氏菌的检测，大量实验也证明酶底物检测大肠埃希菌氏菌的可行性。

随着社会经济发展水平的提升，人们的物质生活条件也明显改善，对于水质检测质量的标准也逐渐提升，加之实验室自身的发展需求，酶底物法对大肠菌群的检测将会是主流方法，由于基层实验室的实验人员不足，一人承担多种工作，为了节省人力物力，提高检测效率，提升实验室能力，提高检测报告的公信力。操作简单，检测省时省力，结果准确的酶底物法特别适合在基层推广应用。

参考文献

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作者简介：唐佳琴（1979—），女，汉族，本科，主管技师，主要从事卫生微生物和病原微生物检测工作，研究分子生物学在病原微生物中的检测应用，从而提升基层卫生应急事件的处置能力。

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唐佳琴¹姜万祥¹